PCR

Seda Güllü / Ege Üniversitesi Biyoloji

            Polimeraz zincir reaksiyonu (Polimerase chain reaction) kısaca PCR bilim dünyasına ilk kez 1985 yılında Kary Mullis tarafından sunulmuştur. Bu buluşundan dolayı Kary Mullis 1993’te Nobel Kimya Ödülü’nü kazanmıştır. PCR, DNA’nın (Deoksiribo Nükleik Asit) hedeflenen bölgesinin bir tüp içerisinde çoğaltılması işlemidir. Çift zincirli DNA (dsDNA), tek zincirli DNA (ssDNA) biçimine çözülür, kopyalanarak çoğaltılır ve tekrar bağlanır (Somma & Querci).

            PCR tekrarlanan 3 basamak şeklinde gerçekleşir;

1.     Denatürasyon: Amplifiye edilecek DNA’nın yüksek sıcaklıkta (94˚C-97˚C) çift sarmal yapısını oluşturan hidrojen bağlarının kırılarak tek iplikli hale gelmesi aşamasıdır.
2.    Anneling (hibridizasyon): Reaksiyon sıcaklığı 45˚C-65˚C’ye düşürülür. Primer adı verilen 15-30 nükleotid uzunluğundaki oligonükleotiderin hedeflenen DNA bölgesine bağlanmasını sağlayan aşamadır. İki adet primer bulunur ve bunlar tek zincirli DNA dizileridir. Primerlerden birisi hedef DNA’nın bir zincirinin 5’ ucuna eşlenik, diğeri de karşıt zincirinin 3’ ucuna eşlenik olmak zorundadır (Klug, Cummings, Spencer, & Palladino, 2018).
3.    Extension (uzama): Sıcaklık tekrar yükseltilir (65˚C-75˚C). Mg⁺² iyonlarının varlığında Taq DNA polimeraz primerleri başlangıç noktası olarak kullanır ve primerlere nükleotid eklenerek DNA zinciri 5’ den 3’ ne doğru sentezlenir. Tek iplikli olan DNA çift iplikli hale getirilmiş olur.

Bu 3 aşamanın gerçekleşmesi sonucunda bir döngü tamamlanmış olur. Yaklaşık 2 ila 5 dakika kadar süren bir döngü hızlı bir şekilde tekrar edilir ve genellikle 20-30 döngü yapılır. Yeni sentezlenen DNA zincirlerinin sayısı her döngüde 2 katına çıkar. PCR, DNA klonlaması için hızlı bir tekniktir. DNA klonlamasındaki konak hücre gereksinimini de ortadan kaldırmıştır (Klug, Cummings, Spencer, & Palladino, 2018).

            PCR’ın temel bileşenleri:

• Ø  Kalıp DNA
• Ø  DNA polimeraz enzimi (Taq DNA polimeraz)
• Ø  Primerler (forward ve revers)
• Ø  Deoksiribonükleosit trifosfatlar= dNTP karışımı (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
• Ø  Tampon ve MgCl₂

PCR’da çift zincirli DNA denatüre olabilmesi için sıcaklık 95˚C’ye kadar çıkartılır. Bu sıcaklığa dayanabilecek bir DNA polimeraz kullanılması gerekmektedir. Bu enzim sıcak kaplıcalardan izole edilen, thermofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus’dan elde edilir. Bir diğeri ise Pfu polimeraz adı verilen bir enzimdir. Bu enzim ise optimum büyüme sıcaklığı 100˚C olan hipertermofil Pyrococcus furiosus bakterisinden elde edilir. Taq polimerazdan bile daha yüksek ısıya dayanıklı olmasının yanı sıra Pfu polimeraz düzeltme aktivitesine de sahip olduğundan yüksek doğruluk gerektiren çalışmalarda özellikle tercih edilir (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2017).

Primerler yukarıda da bahsettiğimiz gibi kalıp DNA’ya tamamlayıcıdırlar ve kalıp DNA ile yüksek oranda bağlanma sağlarlar. PCR sıcaklığı düşerken kalıp DNA zincirlerinin birbirlerine değil de primerlere bağlanması sağlanır.

dNTP karışımı yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. dNTP ise DNA sentezi için gereklidir.

Tampon ise enzim için gereklidir. Tampon içeriği kullanılan enzimin özellik ve tipine bağlıdır (Somma & Querci). Ayrıca pH’ın korunmasını sağlar. Mg⁺² iyonları dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluşturur.

Kalıp DNA ise genomik DNA olabileceği gibi, mumya kalıntıları, fosiiler, kurumuş kan gibi adli tıp örnekleri, tek bir saç teli gibi değişik kaynaklarda elde edilebilir.

            PCR Kullanım Alanları:

•     Genetik hastalıkların tanısında
•        Genetik testler
•         Adli tıp
•         Karşılaştırmalı veya filogentik çalışmalarda
•         Mikrobiyal ekolojide mikrobiyal dünyanın çeşitliliğini ortaya koymak için yapılan çalışmalarda
•        Evrimin aydınlatılmasında
•        İnsanda bakteri ve virüslerin (hepatit, HIV gibi), bulaşmış yiyeceklerde E.coli ve Staphylococcus aureus gibi patojenik bakterilerin tespitinde kullanılır.

Şuan Dünya gündeminde yer alan COVID-19 tanısında da PCR kullanılmaktadır. PCR ile nükleik asit ampligikasyonu yoluyla viral RNA tanımlanıyor (Ak, Mayıs 2020). Hastalardan örnek nazofarenks veya orofarenks’ten steril örnek çubuğu ile alınır. Örnek alma çubukları bir tüp içersinde çözeltiye alınır. Ters transkripsiyon PCR (RT- PCR) tekniği kullanılır. Bu yöntem kalıp RNA molekülünden DNA yapmak için kullanılır. Daha sonra real time PCR (RT-PCR) tekniği kullanılarak çoğaltma işlemi yapılır. Alınan bu örneklerin hepsinde SARS-CoV-2’yi tespit etme şansı aynı olmayabilir. Her bir örnekteki tespit oranı hastadan hastaya değişebilir, hatta bir hastanın hastalık süreci boyunca da değişiklik gösterebilir (Ak, Mayıs 2020).

            Bu konu ile ilgili aşağıdaki linkte yer alan videoyu da izleyebilirsiniz.

https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4&list=LLethPlR3qtZfFDt-4K7wDCA

                                                                                                                                                            

 

                                                                                                                                              Hazırlayan: Seda GÜLLÜ

                                                                                                                      14.05.2020

                                                                                                                                 

                                                                                                                                 

Kaynakça:

Ak, Ö. (Mayıs 2020). Salgınıyla, tedavisiyle, aşısıyla: COVİD-19. Bilim ve Teknik, 14-27.

Klug, W. S., Cummings, M. R., Spencer, C. A., & Palladino, M. A. (2018). Genetik Kavramlar.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. A., & Stahl, D. A. (2017). Brock Mikroorganizmaların Biyolojisi.

Somma, M., & Querci, M. (tarih yok). Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR).

Görsel: https://www.clinisciences.com/en/buy/cat-conventional-pcr-3473.html